美学者发现起搏器通道在超极化下S4螺旋运动的具体机制

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2019年11月28日,来自美国纽约洛克菲勒大学霍华德·休斯医学研究所的Roderick MacKinnon教授带领的团队Cell 杂志上发表题为“Voltage Sensor Movements during Hyperpolarization in the HCN Channel” 的长文,我们歌词 都利用金属交联技术结合冷冻电镜技术选泽了HCN通道在超极化情况汇报下构象的具体特征,并发现了超极化下S4螺旋运动的具体机制。

目前,有关于超极化门控离子通道的研究还很少。HCN通道中的1个相同的电压传感器的特征与去极化门控通道中的电压传感器很类似于于。尤其是,S4螺旋上每三分之一位置携带的正电荷氨基酸和门控电荷转移中心(正电荷通过它在膜上的传递是守恒的)那此基本特征都是类似于于的。其实所有的电压传感器在特征上都是类似于于的,就说 我它们附着在孔隙上的依据是可变的。到目前为止,电压门控离子通道可分为两类:特征域交换和非特征域交换。特征域交换指的是电压传感器靠在由相邻亚基构成的孔隙单元上,Na+、Ca2+和Kv1-Kv7 K+通道都具有特征域交换的电压传感器。特征域交换可不还还可以1个 S4-S5连接螺旋,与膜平面平行;连接螺旋共有1个,每个亚基1个 ,环绕孔隙的门。S4-S5连接器被认为是1个 杠杆,能将S4螺旋运动转移到门上(图一)。

图一

HCN通道中的电压传感器都是特征域交换的,就说 我不趋于稳定螺旋型S4-S5连接器。就说 我,在HCN通道中,S4螺旋传递到孔隙的运动依据肯定是不同的。可不还还可以明确的是,1个 非特征域交换的离子通道不一定要在膜超极化时打开。类似于于电压门控的K+通道Kv10-Kv12和HCN通道一样,属于非特征域交换的电压传感器,就说 我它们在膜去极化时打开。就说 我,HCN是1个 不同于随后熟悉和广泛分析的电压门控Na+、Ca2+和K+通道的电压门控通道。首先,HCN通道在膜超极化时打开,其次,电压传感器都是特征域交换的。不到 ,在HCN通道中,S4螺旋传递到孔隙的运动依据到底是如何的呢?

在不到 外加电场的情况汇报下,HCN通道中的电压传感器采用去极化时的构象,孔隙闭合。既然要研究HCN通道在超极化构象下打开孔门的机制,第一步统统获得稳定的超极化构象特征。使用传统的化学交联剂来稳定构象的尝试都是因交联的位置而产生偏差。本文最终引入金属亲和交联法,利用离子通道的依据来测试当通道门打开时,通常彼此接近的位点之间算是形成了化学交联。在电生理试验中实时监测交联的形成波特率。随后交联键的生成波特率是以通道门控时间尺度依赖的依据,并被控制门控的相同的变量所调控,那统统明,交联的位点由孔门临近的残基形成。作者在早期研究的基础上,将半胱氨酸残基引入门控电荷转移中心(1个 趋于稳定电压传感器中心的氨基酸群,包括1个 苯丙氨酸和几个带负电荷的氨基酸)区域1个 相互接近的位置。在该研究中,我们歌词 都提出,当S4螺旋移动时,精氨酸或赖氨酸残基进入电荷转移中心,一次1个 ,并穿过膜。在HCN通道中,S4上的“每第三位”氨基酸之一(几乎老是精氨酸或赖氨酸)恰好是丝氨酸。于是我们歌词 都将丝氨酸突变为半胱氨酸(S264C),并将门控电荷转移中心的1个 残基突变为半胱氨酸(F186C)。在去极化HCN通道的特征中,那此氨基酸被完美地分离了11个Å。就说 我们歌词 都检测你这俩 双半胱氨酸突变算是能引入门控-情况汇报依赖的金属亲和力交联。在全细胞膜片钳记录中,HCN突变体F186C/S264C通道以电压和时间依赖的依据打开孔门,这与野生型HCN通道类似于于。在那此实验中,细胞膜一现在开使保持在0 mV(能令通道关闭的电压)。当膜超极化时,HCN通道以时间依赖的依据打开。就说 我,当向细胞外溶液中加入5000 mM镉离子(Cd2+)时,依赖于时间的门控消失,通道似乎被锁在了打开情况汇报。当Cd2+从溶液中移除时,通道恢复到野生型门控行为。那此影响取决于在186和264位置的半胱氨酸残基。交联的形成是依赖于孔门情况汇报的,就说 我与通道门控时间尺度相一致。在该实验中,Cd2+被使用了两次。在第一次加进时,细胞膜保持在0 mV,经过两次脉冲,几乎所有通道都被锁定打开。在清洗后第二次加进Cd2+时,不到500%的通道在第一次现在开使脉冲时被锁定打开。那此结果表明,当超极化打开通道时,Cd2+交联越来比较慢趋于稳定,而当通道关闭时,其交联波特率要慢得多。近500%的交联反应趋于稳定第一次加进Cd2+的第一次和第二次脉冲之间。那此实验结果说明,Cd2+交联的形成趋于稳定在通道打开的时间尺度上。

满足那此标准后,我们歌词 都表达并纯化半胱氨酸突变体通道,并在Hg2+趋于稳定下利用冷冻电镜术(Cryoelectron microscopy,cryo-EM)测定其特征。与野生型HCN通道特征相比,S4螺旋向细胞质侧移动,即从264位置到靠近门控电荷转移中心的186位置。你这俩 交联稳定的通道与超极化膜电压下的构象类似于于,被称为“超极化通道”或“超极化构象,”。也把在0 mV下不到 交联的野生型通道称为“去极化通道”。

去极化情况汇报下HCN通道S4螺旋从不到 的位置移动到新位置的过都是趋于稳定二次特征变化。作者发现,S4移动过程中,310螺旋其实仍保持在膜的中心俯近不变,就说 我在并算是特征中由不同的氨基酸形成。当螺旋从胞外向胞内移动时,靠近细胞外冠部的α螺旋的氨基酸可不还还可以重组到310螺旋上边。一起去,当氨基酸从310螺旋现在开使接近细胞内冠部时,它们又可不还还可以重组成1个 α螺旋。随后也发现,在单个Kv特征中都是从α螺旋到310螺旋的转变,称之为“手风琴样效应”(concertina effect)。一些电压传感器中都能观察到310螺旋。310螺旋使S4螺旋上的带正电荷的氨基酸以每次1个 周期性的依据失去脂质环境,进入膜中央俯近的门控电荷转移中心,在那里,未屏蔽电荷的静电不稳定性最大。310螺旋比α螺旋缠绕得系紧,并与更高的能量消耗有关。310螺旋在S4位置上的动态移动很完美的解释了S4螺旋上每三分之一处的正电荷的作用。

随着S4向超极化构象的位移,门控电荷转移中心上边的1个 精氨酸残基R3 (Arg267)和R4 (Arg270)移动到下方。作者还观察到,S4螺旋分裂成1个 螺旋。中含R4的上半每种螺旋,仍然垂直并穿过膜;R4下面每种的螺旋,则几乎变得细胞内膜冠部平行。螺旋断口处由Ser272的侧链进行稳定,它与Leu269的羰基氧形成氢键,从而覆盖了S4垂直段的末端。S4的水平段将R5和R6的侧链导向细胞内溶液,一起去,它将几个亲脂侧链指向脂膜,将色氨酸指向膜-水界面。将去极化构象中的单个的长的跨膜S4螺旋转化为1个 分离的超极化构象螺旋,还可不还还可以明显地减少将每种S4插入到细胞内的水溶液中所带来的能量损失。而精氨酸和赖氨酸残基在水环境中更稳定(能量低)。在此构象中,S4的c端在内膜冠部形成1个 界面螺旋,似乎在那此有利的和不利的相互作用之间达到了并算是平衡。

最终的结果是,S4的新构象使S5螺旋从S6螺旋束上位移一段距离,形成了孔隙的门。为了进一步确认在超极化通道中观察到的S5的位移算是与孔隙打开有关,作者构建了1个 突变体Y289D的特征,该突变体在0 mV时具有很高的打开概率。该突变体的电压传感器采用了与野生型类似于于的去极化构象,结果表明,S5螺旋与超极化通道中相对S6螺旋的偏移方向与野生型相同,统统程度较轻。这两者中S5的类似于于偏移表明,S4通过S5相对于S6的位移来控制HCN通道的门。

研究发现,HCN通道在超极化时,S4螺旋从胞外膜冠部运动到胞内电荷转移中心是1个 从α螺旋到310螺旋再到α螺旋的过程。在此过程中,310螺旋的位置不变,就说 我组成的氨基酸成分随着α螺旋的氨基酸的进入和失去趋于稳定变化。一起去,S4螺旋会断裂成两每种,上边垂直每种保持不变,R4精氨酸残基下面的每种则由不到 的垂直变成与胞内膜冠部平行。你这俩 改变使得临近的S5螺旋改变与S6螺旋的相对位置,从而打开孔门(图二)。你这俩 α螺旋与310螺旋你这俩 双螺旋特征算是也是一些非特征域交换电压门控通道的特征,还是仅仅是超极化门控通道的特征,还有待观察。总之,这篇文章揭示了随后未知的关于HCN通道电压传感的机制。以及,不同通道的电压传感器随后不想趋于稳定相同的构象变化。

图二:模式图

关于起搏器通道

电压依赖蛋白通过改变自身构象来对细胞膜上的电压变化做出反应。你这俩 过程由电压传感器介导,该传感器是并算是有1个跨膜螺旋特征域的蛋白。在电压门控的离子通道中,电压传感器控制孔的门。大多数电压门控离子通道,类似于于Na+、Ca2+和Kv1-Kv7 K+通道,在细胞膜去极化时打开(即当细胞膜内的电压相对于细胞膜外为正时,静息情况汇报下细胞膜电位外正内负)。关于类似于于电压门控通道的研究主要集中在机械力学上。超极化激活的环核苷酸门控通道(hyperpolarization-activated cyclic nucleotide gatedchannel, HCN channel)是并算是罕见的电压门控阳离子通道,在细胞膜超极化时(即当细胞膜内的电压相对于细胞膜外为负时),该通道就会打开。此属性赋予HCN通道具有起搏器的活性,统统有时又被称为起搏器通道。HCN通道趋于稳定心脏和神经系统中,通过起搏器行为控制生理过程。

文章来源: BioArt

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